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NHS-LC生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)素是(shi)一种长(zhang)链(lian)、NHS酯活化的(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)素化试剂，用于标记伯(bo)胺（例如蛋白赖(lai)氨酸），其膜通透性使其可(ke)用于一般(ban)细胞(bao)内标记。磺基(ji)NHS-LC生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)素是(shi)水溶性的(de)(de)(de)、不可(ke)切(qie)割的(de)(de)(de)，可(ke)以对溶液中的(de)(de)(de)抗体、蛋白质和(he)任何其他含伯(bo)胺的(de)(de)(de)大(da)分(fen)子进行简单(dan)有效的(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)素化试剂，细胞(bao)表面蛋白的(de)(de)(de)特(te)异性标记是(shi)这(zhei)些独(du)特(te)的(de)(de)(de)水溶性和(he)膜不可(ke)渗(shen)透试剂的(de)(de)(de)另一个常见应用。

Katsumi团队2001年发表《一种(zhong)利用(yong)内皮生(sheng)(sheng)物(wu)素(su)(su)(su)化(hua)和抗生(sheng)(sheng)物(wu)素(su)(su)(su)蛋白-生(sheng)(sheng)物(wu)素(su)(su)(su)系统(tong)的(de)新型血(xue)管内给药(yao)方法》，此(ci)项研(yan)究中开发了(le)一种(zhong)新型血(xue)管内给药(yao)系统(tong)，将从导管注射(she)的(de)药(yao)物(wu)固定到(dao)靶(ba)组织的(de)血(xue)管系统(tong)中，活内皮细胞的(de)细胞蛋白首先通过生(sheng)(sheng)物(wu)素(su)(su)(su)化(hua)试剂(ji)直接生(sheng)(sheng)物(wu)素(su)(su)(su)化(hua)，然后通过亲(qin)和药(yao)物(wu)或使(shi)用(yong)亲(qin)和素(su)(su)(su)作为接头的(de)生(sheng)(sheng)物(wu)素(su)(su)(su)化(hua)药(yao)物(wu)结(jie)合。

在(zai)最初的(de)(de)(de)(de)实验中，在(zai)体外研(yan)究了培养的(de)(de)(de)(de)牛主动(dong)脉内皮(pi)细(xi)(xi)胞(bao)(bao)（BAECs）的(de)(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)化，方法是将(jiang)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)化试剂(ji)(ji)（NHS-LC生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)或(huo)磺基(ji)(ji)-NHS-LC生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)）应(ying)用(yong)于(yu)洗涤过的(de)(de)(de)(de)完整BAEC单层上(shang)，并表明与细(xi)(xi)胞(bao)(bao)结合(he)的(de)(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)量(liang)取决于(yu)所应(ying)用(yong)的(de)(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)试剂(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)浓度(du)。将(jiang)细(xi)(xi)胞(bao)(bao)裂解(jie)物(wu)(wu)(wu)中生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)的(de)(de)(de)(de)浓度(du)除以裂解(jie)物(wu)(wu)(wu)中的(de)(de)(de)(de)蛋白(bai)质浓度(du)（ng生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)/μg蛋白(bai)质），以使其值(zhi)标(biao)准化，以应(ying)对(dui)实验过程中可(ke)能的(de)(de)(de)(de)细(xi)(xi)胞(bao)(bao)损(sun)失。图1显(xian)示了生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)化试剂(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)剂(ji)(ji)量(liang)与细(xi)(xi)胞(bao)(bao)裂解(jie)物(wu)(wu)(wu)中校正的(de)(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)浓度(du)之(zhi)间的(de)(de)(de)(de)关系(xi)。细(xi)(xi)胞(bao)(bao)裂解(jie)物(wu)(wu)(wu)中生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)的(de)(de)(de)(de)浓度(du)随着生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)化试剂(ji)(ji)剂(ji)(ji)量(liang)的(de)(de)(de)(de)增加而增加。当在(zai)相同浓度(du)下(xia)比较NHS-LC-生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)和磺基(ji)(ji)NHS-LC生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)时(shi)，NHS-LC生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)的(de)(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)化的(de)(de)(de)(de)细(xi)(xi)胞(bao)(bao)蛋白(bai)略(lve)多(duo)。例如，由1.8mM NHS-LC生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)和磺基(ji)(ji)NHS-LC生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)制(zhi)备(bei)的(de)(de)(de)(de)细(xi)(xi)胞(bao)(bao)裂解(jie)物(wu)(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)浓度(du)分别为0.390和0.304ng每1g蛋白(bai)质。

在(zai)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)(su)(su)化后，细(xi)(xi)胞结合的(de)(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)(su)(su)随(sui)着时(shi)(shi)间(jian)的(de)(de)(de)(de)推(tui)(tui)移(yi)而(er)(er)减少，当荧光素(su)(su)(su)(su)标记的(de)(de)(de)(de)亲和素(su)(su)(su)(su)（FITC-avidin）应用于生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)(su)(su)化的(de)(de)(de)(de)BAEC单层时(shi)(shi)，FITC-亲和素(su)(su)(su)(su)很容易与细(xi)(xi)胞结合。LDH释放测(ce)定显(xian)示磺(huang)(huang)基(ji)NHS-LC生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)(su)(su)对(dui)BAEC只(zhi)(zhi)有(you)轻微的(de)(de)(de)(de)细(xi)(xi)胞毒(du)性，集落形成测(ce)定显(xian)示试剂只(zhi)(zhi)有(you)轻微的(de)(de)(de)(de)不良反应。对(dui)正常(chang)家兔的(de)(de)(de)(de)肾(shen)(shen)(shen)动脉进(jin)行(xing)了(le)体内(nei)研究，通过导管将NHS-LC生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)(su)(su)溶液(ye)(ye)注射(she)到(dao)一(yi)个(ge)肾(shen)(shen)(shen)脏(zang)，以生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)(su)(su)化其血管系统，并将载体注射(she)到(dao)另(ling)一(yi)个(ge)肾(shen)(shen)(shen)脏(zang)作(zuo)为对(dui)照(zhao)，然后用盐水灌注。最后，将FITC-avidin溶液(ye)(ye)注射(she)到(dao)两个(ge)肾(shen)(shen)(shen)脏(zang)，然后在(zai)拔(ba)出导管后与血液(ye)(ye)再次(ci)融合。在(zai)组织学切(qie)片中(zhong)(zhong)，生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)(su)(su)化肾(shen)(shen)(shen)脏(zang)中(zhong)(zhong)超(chao)过85%的(de)(de)(de)(de)肾(shen)(shen)(shen)小(xiao)球被荧光素(su)(su)(su)(su)染(ran)色，而(er)(er)对(dui)照(zhao)组中(zhong)(zhong)没有(you)肾(shen)(shen)(shen)小(xiao)球被染(ran)色。在(zai)相同手术后2天采集的(de)(de)(de)(de)肾(shen)(shen)(shen)脏(zang)中(zhong)(zhong)，大多数(shu)肾(shen)(shen)(shen)小(xiao)球仍然染(ran)色明亮。图2显(xian)示，在(zai)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)(su)(su)化后，EC中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)(su)(su)浓(nong)度随(sui)着时(shi)(shi)间(jian)的(de)(de)(de)(de)推(tui)(tui)移(yi)而(er)(er)降(jiang)低。当使(shi)用磺(huang)(huang)基(ji)NHS-LC生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)(su)(su)时(shi)(shi)，生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)(su)(su)化蛋(dan)白的(de)(de)(de)(de)浓(nong)度随(sui)着时(shi)(shi)间(jian)的(de)(de)(de)(de)推(tui)(tui)移(yi)迅速下(xia)降(jiang)，24小(xiao)时(shi)(shi)后只(zhi)(zhi)剩下(xia)少量。另(ling)一(yi)方(fang)面，当使(shi)用NHS-LC-生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)(su)(su)时(shi)(shi)时(shi)(shi)，在(zai)24小(xiao)时(shi)(shi)内(nei)检测(ce)到(dao)大量的(de)(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)(su)(su)分子（60%），在(zai)48小(xiao)时(shi)(shi)时(shi)(shi)仍能(neng)检测(ce)到(dao)约40%。根(gen)据数(shu)据计算出的(de)(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)(su)(su)半(ban)衰期分别(bie)为38.0小(xiao)时(shi)(shi)（NHS-LC生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)(su)(su)）和10.8小(xiao)时(shi)(shi)（磺(huang)(huang)基(ji)-NHS LC-生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)(su)(su)）。

在用0.18-18mM的磺(huang)基NHS-LC生(sheng)物(wu)素(su)和(he)(he)暴露(lu)于溶剂中进行对照，生(sheng)物(wu)素(su)化(hua)24小时后通(tong)过相(xiang)差显(xian)微镜检查了所(suo)(suo)有(you)的BAEC，所(suo)(suo)有(you)组的细胞均为(wei)阴性，未显(xian)示任何形态异常。另一方面，如图3所(suo)(suo)示，与低剂量（0、0.18和(he)(he)1.8mM）的生(sheng)物(wu)素(su)化(hua)相(xiang)比，暴露(lu)于18mM生(sheng)物(wu)素(su)化(hua)试剂的组显(xian)示LDH水平略有(you)增加(jia)（克(ke)鲁斯(si)卡(ka)尔-沃利(li)斯(si)检验，p＜0.02）。

为了(le)研(yan)究生(sheng)物素(su)化抑制剂是(shi)否会改变细(xi)胞活性，使用集(ji)落形成测定法检(jian)测了(le)它们对细(xi)胞增殖的(de)影响。如(ru)图4所示，BAEC集(ji)落的(de)数量随着试剂浓度的(de)增加而(er)减少(shao)。菌落形成的(de)抑制在1.8-5.4mM时是(shi)明显的(de)（克鲁斯卡尔-沃利斯检(jian)验检(jian)验，p<0.01）。

在这个实验中(zhong)，还研究了(le)抗生(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)化(hua)药物(wu)(wu)(wu)是否(fou)可以固定在有活力的(de)(de)生(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)化(hua)EC上。结果如图(tu)5所(suo)示，细胞裂(lie)解物(wu)(wu)(wu)中(zhong)FITC抗生(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)的(de)(de)浓度随(sui)着FITC抗病(bing)毒素(su)初(chu)始(shi)剂(ji)量(liang)的(de)(de)增(zeng)加(jia)而(er)增(zeng)加(jia)。当使用(yong)NHS-LC生(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)时(shi)(shi)，FITC-avidin的(de)(de)初(chu)始(shi)剂(ji)量(liang)与其在细胞裂(lie)解物(wu)(wu)(wu)中(zhong)的(de)(de)浓度之间(jian)的(de)(de)相(xiang)关系数为(wei)0.987（p=0.012），而(er)当使用(yong)磺基(ji)NHS-LC-生(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)时(shi)(shi)为(wei)0.977（p=0.026）。

在(zai)(zai)最终(zhong)的(de)实验(yan)中，生(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)化(hua)的(de)肾脏(zang)(zang)注射(she)抗生(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)溶液(ye)，然(ran)后注射(she)荧光素(su)(su)-生(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)溶液(ye)。对照(zhao)肾脏(zang)(zang)先前没(mei)有(you)生(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)化(hua)，但接受了(le)与上述相同的(de)抗生(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)和荧光素(su)(su)生(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)注射(she)，超过(guo)80%的(de)肾小球在(zai)(zai)生(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)化(hua)的(de)肾脏(zang)(zang)中染色，但在(zai)(zai)对照(zhao)组中没(mei)有(you)染色。这表(biao)明(ming)生(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)化(hua)药(yao)物(wu)(wu)(wu)可以通(tong)过(guo)抗生(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)锚定在(zai)(zai)生(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)化(hua)血管(guan)系统上，而不会被血液(ye)冲走。生(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)化(hua)肾脏(zang)(zang)的(de)功能未(wei)发(fa)现明(ming)显的(de)不良反(fan)应，这种给药(yao)系统适用于治疗(liao)某些(xie)血管(guan)病理状况，如恶性肿瘤中的(de)微血管(guan)增(zeng)殖，以及在(zai)(zai)某些(xie)靶器官中连(lian)续给药(yao)。

在这项(xiang)研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)(jiu)中(zhong)，研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)(jiu)了(le)活内皮细(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)素化(hua)(hua)，以开发一(yi)种将(jiang)治(zhi)疗药物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)递送到靶区(qu)并将(jiang)药物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)锚定到该区(qu)域的(de)(de)(de)(de)(de)(de)血管(guan)(guan)(guan)(guan)(guan)内皮细(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)方(fang)法(fa)。这项(xiang)研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)(jiu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)两个关键(jian)要(yao)素是导(dao)(dao)管(guan)(guan)(guan)(guan)(guan)插(cha)(cha)入术(shu)(shu)在药物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)递送中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)应(ying)用(yong)(yong)(yong)(yong)和NHS酯(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)素衍生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)在生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)素化(hua)(hua)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)使用(yong)(yong)(yong)(yong)。介(jie)入放射(she)学(xue)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)最(zui)新进(jin)展使得使用(yong)(yong)(yong)(yong)血管(guan)(guan)(guan)(guan)(guan)导(dao)(dao)管(guan)(guan)(guan)(guan)(guan)插(cha)(cha)入术(shu)(shu)到达身(shen)体(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)许多地方(fang)成(cheng)为(wei)可能，使用(yong)(yong)(yong)(yong)导(dao)(dao)管(guan)(guan)(guan)(guan)(guan)插(cha)(cha)入术(shu)(shu)，我们将(jiang)药物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)输送到作(zuo)为(wei)模型器官的(de)(de)(de)(de)(de)(de)兔肾脏中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)血管(guan)(guan)(guan)(guan)(guan)内皮细(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)。一(yi)些研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)(jiu)人员(yuan)之前已经(jing)报道了(le)动物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)组织细(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)素化(hua)(hua)，如红细(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)、淋巴(ba)细(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)和内皮细(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，使用(yong)(yong)(yong)(yong)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)素NHS酯(zhi)(zhi)(zhi)衍生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)用(yong)(yong)(yong)(yong)于各种目的(de)(de)(de)(de)(de)(de)。NHS酯(zhi)(zhi)(zhi)与(yu)蛋(dan)白质具有高度反应(ying)性，与(yu)NHS酯(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)化(hua)(hua)合物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)可以通(tong)过细(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)蛋(dan)白质固定在活细(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)上。Fuente等人报道了(le)使用(yong)(yong)(yong)(yong)分离的(de)(de)(de)(de)(de)(de)肺对肺内皮进(jin)行生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)素化(hua)(hua)，然后(hou)通(tong)过血管(guan)(guan)(guan)(guan)(guan)内注(zhu)射(she)给(ji)予生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)素化(hua)(hua)试剂。Katsumi团(tuan)队的(de)(de)(de)(de)(de)(de)研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)(jiu)首次将(jiang)血管(guan)(guan)(guan)(guan)(guan)内皮细(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)素化(hua)(hua)用(yong)(yong)(yong)(yong)于治(zhi)疗目的(de)(de)(de)(de)(de)(de)。